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细胞准备:将细胞悬浮在适当的缓冲液中,并调整细胞浓度。
制片:在显微镜载玻片上铺上一层低熔点的琼脂糖,然后将细胞悬液与琼脂糖混合后铺在第一层上,最后再覆盖一层琼脂糖。
细胞裂解:将制片置于裂解液中,通常在4°C下裂解1小时以上,以使细胞膜和核膜破裂,释放出DNA。
DNA解旋:将裂解后的载玻片放入电泳槽中,用碱性缓冲液处理以解旋DNA。
电泳:在电泳槽中施加电场,使DNA片段在电场作用下迁移。损伤的DNA片段因为较小而迁移得更快,形成“彗星”头部(密集的DNA片段)和尾部(散开的损伤片段)。
中和:电泳结束后,用中性缓冲液中和载玻片上的碱性条件。
染色:使用荧光染料(如乙啶或SYBR Green)对DNA进行染色。
观察和分析:在荧光显微镜下观察彗星,并使用图像分析软件对彗星的头尾长度、尾部面积等参数进行定量分析。
二、彗星实验的应用:
环境监测:检测环境中的遗传毒性物质。
癌症研究:评估肿瘤细胞中的DNA损伤和修复能力。
药物开发:筛选具有遗传毒性的药物候选物。
辐射生物学:研究辐射对DNA的损伤效应。
三、注意事项:
实验过程中应避免DNA的进一步损伤,如避免紫外线照射和化学污染。
需要严格控制实验条件,包括琼脂糖的浓度、电泳电压和时间等,以确保实验的可重复性。
应该有适当的对照组,如未处理的细胞或已知DNA损伤剂处理的细胞,以便于比较。
1. 细胞类型,客户是否提供细胞;
2. DNA损伤模型构建方法;
3. 彗星图片视野需要几个细胞。
1. 细胞株 400/株,贴壁细胞80元培养至6孔细胞量,悬浮细胞100元培养至6孔细胞量;客户提供300/株适应性培养1-2周;
2. 药物处理费用一个药物150元,载体转染费用一个载体60元;
3. 彗星检测试剂盒12T 1440,检测费用 300元/样。
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