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①样本制备:
细胞:将细胞培养在载玻片或培养皿中,然后在适当的时候进行固定(通常使用多聚甲醛)和透化(使用透化剂如Triton X-100)。
组织切片:将组织冷冻切片或石蜡切片固定在载玻片上,然后进行脱蜡和透化。
②封闭:为了减少非特异性结合,通常会用含有血清或脱脂奶粉的封闭剂处理样本。
③一抗孵育:将针对目标抗原的特异性一抗(通常是初级抗体)加到样本上,并在适当的条件下孵育(通常在湿盒中过夜)。
④清洗:用缓冲液清洗样本,以去除未结合的初级抗体。
⑤二抗孵育:加入荧光标记的二抗(通常是针对初级抗体的种属特异性抗体),在适当条件下孵育。
⑥清洗:再次清洗样本,去除未结合的二抗。
⑦封片:使用含有抗淬灭剂的封片剂(如含DAPI的甘油或PVA)封片。
⑧荧光显微镜观察:在荧光显微镜下观察样本,并使用适当的滤光片来激发荧光染料。
⑨图像获取和分析:通过显微镜摄像头获取荧光图像,并使用图像分析软件进行定量分析。
2. 荧光染料:
免疫荧光实验中常用的荧光染料包括FITC(绿色)、TRITC(红色)、Cy3(红色)、Cy5(远红色)、Alexa Fluor系列、PE(藻红蛋白)等。3. 应用:
①细胞和组织的形态学分析。
②蛋白质定位和表达水平的检测。
③细胞内信号传导途径的研究。
④病理组织的诊断。
4. 注意事项:
①确保抗体与样本种属的兼容性。
②避免荧光淬灭,使用适当的封片剂和抗淬灭剂。
③控制实验条件,如抗体浓度、孵育时间和温度。
④进行适当的对照实验,如仅加二抗的阴性对照和已知阳性样本的阳性对照。
免疫荧光技术因其灵敏度高、特异性强、操作简便和能够实现多重标记等优点,在生物学和医学研究中得到了广泛应用。1. 细胞类型,客户是否提供细胞;
2. 客户是否提供抗体;
3. 拍照的时候需要共聚焦显微镜拍照还是普通荧光显微镜拍照。
1. 细胞株 400/株,贴壁细胞80元培养至6孔细胞量,悬浮细胞100元培养至6孔细胞量;客户提供300/株适应性培养1-2周;
2. 药物处理费用一个药物150,载体转染费用一个载体60;
3. 细胞爬片30元/片;
4. 普通免疫荧光单标检测 40元/片,普通免疫荧光双标检测 60元/片,抗体购买费用另算;
5. 荧光分析 20/套。
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